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헤모글로빈-전분복합체 혈액 산소 운반체 32377
없음 2000-11-09
헤모글로빈-전분복합체 혈액 산소 운반체

발명 배경

여기 소개되는 발명은 혈액의 산소운반용 물질로 헤모글로빈과 히드록시에칠(hydroxyethyl, HE) 전분의 복합체에 관한 것이다. 이 발명은 제조 공정을 포함하고 있으며 혈액 대체물질, 플라스마 증진제, 관류제(perfusion agent), 혈액 희석제(hemodilution agent), 심장 보존액(cardioplegic solution)을 포함한 산소 운반용 물질로서의 사용을 포함한다. 혈액 대용물질로 사용될 수 있으며, 기질(stroma)이 없는 헤모글로빈소재 산소 운반체(HBOCs) 용액을 개발하는 노력은 오래 전부터 이루어져 왔으나 여전히 의약분야의 시급한 개발과제의 하나로 간주되고 있는 실정이다.
사고 또는 수술로 인한 혈액의 손실을 대처하는 방안은 대부분 동종간의(allogenic) 수혈에 의존하고 있다. 이 과정에서 수반되는 병원성 생물체들, 특히 HIV 또는 간염과 같은 바이러스의 오염은 해결되기 어려운 문제점으로 남아있다. 또한 혈액을 현재의 시스템외의 전문적인 그룹으로 분류해야할 필요성이 오래 전부터 요구되어 왔으며, 이는 과학적인 문헌상으로도 널리 알려져 있는 내용이다. 한편 혈액 대용품으로 사용될 수 있는 HBOC 제품은 또한 플라스마 증진제, 관류제, 혈액 희석제, 그리고 심장 보존액으로도 사용이 가능하다. 하지만 이러한 요구에도 불구하고 현재 알려진 어떠한 HBOC제품도 의료용으로 승인되어 있는 것이 없는 실정이다.
천연의 혈액내 산소 운반체는 혈액 색소인 분자량 6만4천의 헤모글로빈 단백질이다. 이 단백질은 두 개의 알파와 베타 펩타이드 사슬을 가지고 있으며 각각 하나의 헴이라는 특수한 구조의 기능기를 갖는다. 이 헴은 링 구조로 되어 있으며 중앙에 철(Fe)원자를 하나 가지고 있다. 헤모글로빈이 혈액으로부터 분리되면 매우 불안정하여 더욱 안정된 형태인 3만2천 달톤의 알파, 베타-다이머(dimer)로 쉽게 분리된다. 이 다이머는 신장에 독성을 나타내는 부가적인 영향을 보이게 된다. 초기에 만들어진 HBOC 제품들은 세포성분으로 오염되어 이러한 독성을 나타냈다. 또한 분리된 헤모글로빈은 2,3-이인산 글리세린산 (diphosphoglycerate, DPG)라는 물질이 결핍되어 있는데 이 물질은 천연적으로 산소 결합을 조절하는 역할을 한다. 이 결과 분리된 헤모글로빈은 산소와의 결합력이 강하게 되어 산소가 쉽게 분리되지 않는 문제점이 생기게 된다.
따라서 산소의 운반특성을 향상시키면서 신장에 대한 독성효과를 없애는 것이 헤모글로빈 유도체를 개발하는데 주된 목적이 되어왔다. 본 발명에서는 헤모글로빈 분자 내부에 또는 분자간에 가교결합(cross-linking)을 시킴으로서 고분자의 헤모글로빈상태인 HBOC를 제조하였다. 따라서 가교결합의 형태가 분자내와 분자간 혼합된 헤모글로빈 유도체가 만들어지며 이 물질의 사용에 대해서도 검토하였다. 가교결합을 위해서는 두 개의 또는 다수의 기능기를 갖는 가교제로 반응시키며 이 반응은 선택적이 될 수도, 비선택적이 될 수도 있다. 선택적 가교반응의 하나로는, 헤모글로빈의 두 단백질 사슬을 분자내 결합시킴으로서 분리된 헤모글로빈의 천연적인 사중합체(tetrametic form)를 안정화시키는 경우가 있다.
한편 적절한 가교제를 선택하는 것은 체내에 이용될 때 산소에 대한 흡착력의 조절도 가능해진다. 이러한 가교제로는 피리독살 인산(pyridoxal phosphate)과 디아스피린(diaspirin) 및 그 유도체가 있을 수 있다. 비선택적인 가교반응에서는 분자간 결합된 고분자의 HBOC 제품이 얻어지는데 적절한 가교제의 사용 및 그 공정에 관해서는 다수의 특허가 이미 발표되어있다.
이미 알려진 헤모글로빈 복합체들에 관해서는 Xue와 Wong에 의해 잘 정리 보고된 바 있다 (Methods in Enzymol. 231, 1994년). 최근에 발표된 특허의 한 예로 헤모글로빈이 히드록시에칠 전분에 결합된 것이 있는데 이 특허에서는 히드록시에칠 전분을 sodium periodate로 처리하여 디알데히드(dialdehyde) 전분을 만들어서 이용한다. 산화된 디알데히드기는 헤모글로빈과 결합을 쉽게 하여 복합체를 형성하게된다. 한편 히드록시에칠 전분에 cyanogen bromide와 같은 가교제를 처리한 뒤, 헤모글로빈을 결합시키는 방법도 있다. 이 헤모글로빈 유도체의 산소 결합력은 헴의 구조에 영향을 주는 가교 또는 고분자를 형성하는 과정과 사용되는 가교제 및 중합제에 의존한다. 산화된 헤모글로빈은 3가 철이온을 가지는 메트-헤모글로빈으로 산화되며 이 산화물은 매우 높은 산소 결합력을 나타낸다. 따라서 HBOC를 제조하는 공정은 완전히 또는 부분적으로 산소가 결합하지 않은 상태의 헤모글로빈을 이용하여 수행된다.
그러나 이러한 가교 또는 복합체 형태의 HBOC 제조공정으로는 특별한 고분자에 헤모글로빈을 선택적으로 결합시키는 것이 가능하지 않다. 모든 공정에서 얻어지는 제품은 다양한 형태의 고분자가 혼합된 형태이며 각각의 고분자는 생리적 특성이 서로 다르다. 특히 매우 높은 분자량의 고분자와 남아있는 사중합체는 독성을 나타내며 이러한 큰 고분자 및 저분자 물질을 제거하기 위해 수율의 손실이 커지며 공정이 비실용적이 되는 요인이 되고 있다. 또한 현재까지 개발된 HBOC제품은 혈관에서 추가적으로 부작용을 나타낸다. 최근의 임상실험에 의하면 저분자 물질, 특히 사중합체는 혈액 순환계로부터 혈관 내부막에 있는 세포로 이동하게 된다. 헤모글로빈의 일산화질소에 대한 높은 흡착력은 이 조직에 일산화질소 함량을 급격히 감소시켜 결국은 고혈압을 유발시킬 수 있다. 또 다른 독성 부작용으로는 적혈구 밖에 존재하는 헤모글로빈 분자가 산화-환원 반응으로 인해 침전되는 현상으로 이 결과 매우 반응성이 높은 헤모글로빈과 산소가 생성되어 지방질의 과산화반응을 유발하게 된다. 최근에 HBOC 제품의 독성 부작용을 줄이기 위해 헤모글로빈을 리포좀(liposomes)내부에 포접시킨 뒤 투여하는 방법이 개발되었다. 그러나 리포좀에 사용되는 과량의 인지질로 인해 환자에게 여기치 않는 위험을 가져올 수 있는 문제점이 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이 현재까지 소개되어 있는 다양한 HBOC 제품들은 부적합한 특성 및 부작용으로 인해 혈액의 산소 운반체로서 의약적 사용이 허용되어있지 않다.

발명 내용

본 발명의 목적은 현재까지 개발되어 있는 헤모글로빈 제품과는 달리, 임상적으로 혈액 대용체로서 사용이 가능한 산소 운반체를 개발하는데 있으며, 부가적으로 산소운반체의 적절한 제조공정을 제공하는데 있다.
이 발명에 의해 개발된 헤모글로빈-히드록시에칠 전분 복합체는 놀랍게도 체내에서 내성이 우수해서 산소 운반체로 매우 적절한 결과를 보였다. 이 물질이 가지고 있는 산소 결합력은 체내에서 필요한 가역적 산소결합을 허용하였으며, 물질의 크기가 충분히 커서 혈관내벽 세포로 침투하는 경향이 없다. 이 산소 운반체는 항원성 또는 발열성 성분을 가지고 있지 않으며 신장 독성 부작용도 없다. 이 발명에 의하면 히드록시에칠 전분이 그 특유의 유변학적(rheological) 특성으로 인해 혈액 희석제와 부피 치환제로서 적합하였다. 따라서 산소 운반물질로서의 우수한 내성은 헤모글로빈의 산소 운반특성과 히드록시에칠 전분의 혈액 희석특성의 조합으로 가능하게 된 것이다. 산소 운반체는 혈관 지속성을 함께 가지며 헤모글로빈 분자의 표면은 치환제로서 보호된다. 놀랍게도 발명된 산소운반체의 헤모글로빈은 이러한 보호작용에 의해서 독성을 나타내는 산화-환원반응으로부터 침전되지 않는다. 또 다른 장점으로는 히드록시에칠 전분과 헤모글로빈을 복합체로서, 콜로이드상의 삼투압이 형성되지 않고 높은 농도로 동시에 투여할 수 있다는 점이다. 이 산소운반체는 헤모글로빈-전분 복합체를 2-40g/dL, 특히 8-20g/dL의 농도로 사용되며, 나가서는 생리적 내성이 있는 운반체, 희석제 또는 excipient를 함유한다.
이 발명에서는 기질(stroma)이 함유되어 있지 않는 정제 및 살균된 헤모글로빈을 이용하며, 사람뿐 아니라 동물, 식물 또는 재조합 생물체에서 얻어질 수 있다. 변성전분은 헤모글로빈을 보호하는 역할을 하여 동물성 헤모글로빈이 사용될 경우 생길 수 있는 면역상의 문제점을 막아준다. 헤모글로빈의 원료로, 소에서 얻어진 것이 특히 우수한 산소흡착 특성을 가지고 있으며 본 발명의 복합체 제조에 매우 바람직하다. 하지만 사람에서 얻어진 헤모글로빈은 가교에 의해 사중합체로 안정화되어야 하며, 적절한 가교공정은 bis-pyridoxal tetraphosphate에 의한 분자내 가교 또는 산화된 라피노즈(raffinose)에 의한 가교반응을 포함한다. 전분과 결합시키기 전에 헤모글로빈은 완전히 또는 부분적으로 탈산소화되는 것이 바람직하다. 탈산소화된 헤모글로빈은 전체의 50-80%가 적당하다. 탈산소화 과정은 화학적 또는 물리적 방법으로 가능한데, 아스콜빈산, 글루타치온, N-아세칠 시스틴(cysteine), N-아세칠 메치오닌 등의 환원제를 사용할 수 있으며, 가스가 통하는 막을 사용하여 불활성 가스(질소, 헬륨, 아르곤 등)를 순환시킬 수 있다. 특히, 시스틴 또는 아세칠 시스틴이 바람직하며 산화 헤모글로빈의 함량이 1% 이하가 될 때까지 계속한다. 메트-헤모글로빈은 0.5% 이하가 바람직하다.
다른 형태의 헤모글로빈 유도체로는 안정한 CO를 갖는 형태가 가능하며 일산화탄소를 주입하면 생성될 수 있다. 반응 후 ultrafiltration으로 회수한 뒤 질소상에서 냉동건조하여 제품을 얻는다.
복합체를 만들 때 전분의 평균분자량은 5천 -2만 달톤정도가 바람직하며, 히드록시에칠 치환도는 0.1 - 0.8, C2:C6 치환 비율은 2-20이 적당하다. 상용의 히드록시에칠 전분을 사용하여 산 가수분해로 분자량을 조절할 수 있다. 헤모글로빈-전분 복합체의 분자량은 20만 - 30만 정도가 특히 적절하다. 저분자의 히드록시에칠 전분은 헤모글로빈을 안정하게 만든다. 따라서 여기에서 발명된 산소운반체는 변성되지 않은 HBOC에 비해 섭씨 4도 또는 실온에서 저장기간이 높았다.
본 발명은 산소 운반체의 제조공정을 포함하고 있는데 최초로 헤모글로빈을 전분에 선택적으로 결합시킨 공정이라고 할 수 있다. 먼저 히드록시에칠 전분의 환원기를 요오드로 산화시킨 뒤 헤모글로빈의 유리아미노기를 이용하여 아미드(amide)결합으로 이 산화말단기에 결합시킨다. 이 공정의 기본원리는 1992년 하시모토 등(Hashimoto et al.)에 의해 발표된 바 있는데 다당류 또는 폴리아미드(polyamides)와 정제된 헤모글로빈을 결합하여 블록 고분자(block copolymers)를 생성하는 것이었다. 본 연구에서 얻어진 제품은 바람직하지 않은 높은 분자량의 고분자 헤모글로빈이 거의 형성되지 않았고, 사중합체의 헤모글로빈과 전분과의 결합정도를 조절할 수 있게 되었다. 또한 거의 정량적으로 헤모글로빈과 전분과 반응이 일어나며 잔유하는 저분자 헤모글로빈의 함량도 5%이하로 매우 적다.
본 발명에서는 헤모글로빈-전분 복합체와 함께 알부민(albumin)을 혼합하여 산소운반체로 사용할 수도 있다. 이 때 알부민은 사람, 동물 또는 재조합된 생물체에서 얻어질 수 있으며 액상으로 조합되는 것이 바람직하다. 알부민의 농도는 5-15 g/d의 농도가 적당하다. 알부민이 헤모글로빈-전분 복합체보다 가격이 훨씬 저렴하므로 알부민을 혼합함으로서 경제성을 높일 수 있으며 산소운반체의 삼투압을 조절하는 목적으로 이용될 수 있다. 헤모글로빈-전분 복합체와 알부민과의 함량비율은 1:10 - 4:1로 넓은 비율로 사용이 가능하다. 또한 알부민이 혼합된 헤모글로빈-전분 복합체는 혈관에서 매우 우수한 내성을 갖는다. 특히 일산화질소로 포화된 상태의 혼합물은 매우 우수한 혈관 내성을 갖는데 이 때 단순히 일산화질소 가스로 순환시켜줌으로서 NO-결합된 상태의 단백질을 얻게 되며 이로서 혈관내성 및 산소와의 결합특성이 향상된다.

발명예

A1. 히드록시에칠 전분 환원기의 산화: 히드록시에칠 전분의 환원기는 0.1 N 요오드 용액을 사용해서 선택적으로 산화시킬 수 있다. 0.56 mmol의 전분(분자량 4,000이하)을 함유하는 3 ml의 증류수 용액에 2 ml의 요오드 용액을 서서히 가한다. 색이 없어질 때까지 0.1 N KOH 용액을 (약 3.3 ml) 첨가한다. 이 과정을 계속하여 14 ml의 요오드 용액이 소모되게 한 뒤 실온에서 30분간 더 교반한다. 양이온 교환수지(Amberite IR120)을 이용하여 용액을 정제하고, 1000 달톤 사이즈의 셀룰로즈 막을 사용하여 투석 여과한 뒤 부분 농축된 용액을 냉동건조한다. 양이온 크로마토그래피는 여과한 후에 이용할 수도 있다. 전체적인 수율은 80-90%이다.

A2. 또 다른 산화공정으로 분자량이 10,000이하인 전분을 5 그램 사용한다. 기타 공정은 A1과 동일한데 9,000 달톤 사이즈의 투석막을 사용한다. 이 때 수율은 약 85%이다.

B1. 헤모글로빈의 탈산소화: 0.5 M NaCl, 0.1 M Na2HPO4, 0.05 M NaHCO3 용액에 6 g/dl의 농도로 들어있는 소 헤모글로빈을 가스로 환원한다. 이 용액상 헤모글로빈은 94-96%가 CO형태로 존재한다. 밀폐된 용기에 헤모글로빈 용액을 넣고 가스 교환기로 가스를 순환시킨다. 이 때 부분적 산화를 위해 가스교환 막(membrane)은 먼저 산소로 계속로 주입된 뒤 10 psi의 압력으로 질소를 주입하게 된다. 탈산소화는 70%의 탈산소 헤모글로빈 함량이 되면 종료되며 헤모글로빈은 질소하에서 냉동건조된다.

B2. 화학적 환원: 동일한 헤모글로빈 용액을 이용하여 화학적으로 환원할 수도 있다. 이 때 100 mM의 Na disulphite를 헤모글로빈 용액에 주입하고 한 시간 뒤 75%의 탈산소 헤모글로빈이 얻어진다. 50,000사이즈 막을 이용하여 ultrafiltration하여 환원제를 제거하고 헤모글로빈을 냉동건조한다.

C. 헤모글로빈과 전분과의 결합: B1과 B2에서 제조된 헤모글로빈 각각을 15 ml의 DMSO에 넣고 100 ml의 삼구플라스크에 옮긴다. A공정으로 제조된 전분을 0.5 ml DMSO에 녹이고 삼구 플라스크에 서서히 첨가한다. 이 때 온도는 섭씨 40도를 유지하며 하루 - 이틀간 지속적으로 교반한다. 이후 투석과 여과로서 부분 농축하여 제품을 얻는다. 크로마토그래피 또는 ultrafiltration을 이용하면 잔유하는 초기반응물을 제거하므로 순도를 높일 수 있다.

발명자: K. Sommermeyer and W. Eichner
게재지: 미국특허 6,083,909 (2000)

* 인용 : 옥수수 뉴스 No.77 (미국곡물협회 발행)